Eine Zelle enthält mehrere hunderttausend tRNA-Moleküle, von denen jedes nur aus 70 bis 90 Nukleotiden besteht, die zu einem kleeblattartigen Muster gefaltet sind. An einem Ende tragen tRNAs eine der zwanzig Aminosäuren, die als Proteinbausteine ​​dienen, während sich das andere Ende mit dem Codon paart, das diese Aminosäure in der Messenger-RNA während der Translation spezifiziert. Obwohl es nur 61 Codons für die zwanzig Aminosäuren gibt, können Zellen aus verschiedenen Organismen Hunderte von einzigartigen tRNA-Molekülen enthalten, von denen sich einige nur durch ein einziges Nukleotid voneinander unterscheiden. Viele Nukleotide in tRNAs sind auch mit chemischen Modifikationen dekoriert, die dazu beitragen, dass tRNAs das richtige Codon falten oder binden.

Die Spiegel einzelner tRNAs werden in verschiedenen Geweben und während der Entwicklung dynamisch reguliert, und tRNA-Defekte sind mit neurogischen Erkrankungen und Krebs verbunden. Die molekularen Ursprünge dieser Verbindungen bleiben unklar, da die Quantifizierung der Häufigkeit und Modifikation von tRNAs in Zellen lange Zeit eine Herausforderung geblieben ist. Das Team von Danny Nedialkova am MPI für Biochemie hat jetzt mim-tRNAseq entwickelt, eine Methode, die die Häufigkeit und den Modifikationsstatus verschiedener tRNAs in Zellen genau misst.

Änderungshindernisse und -auflösungen
Um die Spiegel mehrerer RNAs gleichzeitig zu messen, verwenden Wissenschaftler ein Enzym namens Reverse Transkriptase, um zuerst RNA in DNA umzuschreiben. Millionen dieser DNA-Kopien können dann durch Hochdurchsatzsequenzierung parallel quantifiziert werden. Das Umschreiben von tRNAs in DNA war enorm schwierig, da viele tRNA-Modifikationen die reverse Transkriptase blockieren und die Synthese von DNA stoppen. „Viele Forschungen haben elegante Lösungen für dieses Problem vorgeschlagen, aber alle lösen nur einen Bruchteil der Modifikationsblockaden in tRNAs“, erklärt Danny Nedialkova, Leiter der Max-Planck-Forschungsgruppe am MPI für Biochemie. „Wir haben festgestellt, dass eine bestimmte reverse Transkriptase beim Lesen durch modifizierte tRNA-Stellen viel besser zu sein scheint. Durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen konnten wir die Effizienz des Enzyms signifikant verbessern. Damit kann es nahezu alle Hindernisse für die tRNA-Modifikation durchlesen “, fügt Nedialkova hinzu. Dies ermöglichte es, DNA-Bibliotheken aus tRNA-Kopien voller Länge zu konstruieren und sie für die Hochdurchsatzsequenzierung zu verwenden.

Das mim-tRNAseq-Computer-Toolkit
Die Analyse der resultierenden Sequenzierungsdaten war ebenfalls mit erheblichen Herausforderungen verbunden. „Wir haben zwei Hauptprobleme identifiziert: Das erste ist die weitgehende Sequenzähnlichkeit zwischen verschiedenen tRNA-Transkripten“, erklärt Andrew Behrens, Doktorand in Nedialkovas Gruppe und Erstautor der Arbeit. „Das zweite Problem beruht auf der Tatsache, dass ein falsches Nukleotid ( Während der reversen Transkription wird an vielen modifizierten Stellen eine Fehlinkorporation eingeführt. Beide machen es äußerst schwierig, jede gelesene DNA dem tRNA-Molekül zuzuordnen, aus dem sie stammt “, fügt Behrens hinzu. Das Team ging diese Probleme mit neuartigen Berechnungsansätzen an, einschließlich der Verwendung von Modifikation Anmerkung zur Führung der genauen Leseausrichtung. Das resultierende umfassende Toolkit wird zur Ausrichtung in eine frei verfügbare Pipeline gepackt.https://github.com/nedialkova-lab/mim-tRNAseq ). Forscher können mim-tRNAseq verwenden, um nicht nur die tRNA-Häufigkeit zu messen, sondern auch tRNA-Modifikationen abzubilden und zu quantifizieren, die durch die reverse Transkriptase Nukleotid-Fehlinkorporationen induzieren. „Mim-tRNAseq eröffnet unzählige Möglichkeiten für die Zukunft“, sagt Nedialkova. „Wir erwarten, dass es uns und anderen helfen wird, viele offene Fragen zur tRNA-Biologie in Bezug auf Gesundheit und Krankheit zu beantworten.“